Etape proiect
Etapa 1/2022 (Perioada de raportare: 01.06.2022 – 31.12.2022). Testarea riscului proaritmogen si analiza mecanismelor de transport prin BBB a cenobamatului (CBM) – partea I
Rezumat: Ȋn Etapa 1/2022 din cadrul proiectului PCE 39/2022, au fost standardizate protocoalele de electrofiziologie in vitro şi de imunomarcare fluorescentă. Au fost analizate efectele cenobamatului (CBM), la concentraţii mici fiziologice (10 şi 20 μM) asupra canalelor ionice cardiace şi asupra barierei hametoencefalice. A fost testat efectul proaritmogen al CBM prin ȋnregistrări de patch-clamp modul voltage-clamp ȋn configuraţia whole-cell pe linia celulară HEK293T transfectată cu canale ionice cardiace umane hERG1. Rezultatele preliminare au indicat că 20 μM CBM nu inhibă hERG1, dar modifică cinetica de activare şi inactivare a canalului hERG1. De asemenea a fost testat efectul 10 μM CBM asupra celulor endoteliale din microvasculaţia cerebrală umană HBEC5i prin analiza modificărilor de expresie a proteinelor joncţiunilor strȃnse şi a pompelor de eflux prin imunomarcarea fluorescentă urmată de analiza de microscopie confocală. Rezultatele preliminare au indicat o scădere a expresiei ZO-1 şi claudinei-5 şi o creştere a expresiei P-gp după expunerea celulelor endoteliale la cenobamat, 10 μM timp de 24 ore.
Etapa 2/2023 (Perioada de raportare: 01.01.2023 – 31.12.2023). Testarea riscului proaritmogen si analiza mecanismelor de transport prin BBB a CBM (partea II) si a FFA
Rezumat: Cenobamatul aplicat la concentraţii în intervalul relevant clinic (valori medii Cmax de 45.5 µg/ml=169.98 µM au fost obţinute în trial-uri clinice umane prin administrarea a 400 mg/zi p.o. timp de 14 zile consecutiv – studiul YKP3089C018) a dus la inhibarea semnificativă a canalelor ionice cardiace Nav1.5 şi Cav1.2, ce poate explica efectele de scurtare dependentă de doză a intervalului QTc. Simulările computerizate cu un model O’Hara-Rudy 2011 completat cu date farmacologice, în special legate de blocarea dependentă de stare a Nav1.5, au reprodus efectul de scurtare dependentă de doză a duratei potenţialelor de acţiune, efecte relevante apărând şi la 0.5 x Cmax. Aceste efecte blocante, în special asupra Nav1.5, deşi considerate în general a exercita efecte antiaritmice prin scăderea vitezei de propagare a depolarizării în miocard, pot declanşa aritmii de reintrare în condiţii patologice cum ar fi ischemia miocardică sau alte afecţiuni cardiace structurale. Ambele medicamente permeabilizează monostratul endotelial, şi scad nivelul expresiei ZO-1, claudin-5, si al expresia P-gp, ceea ce poate contribui la instalarea unor rezistentei la medicamente la nivelul BBB. Considerand efectele celor două medicamente canalelor ionice cardiace umane şi asupra celulelor endoteliale din microvasculatura umana, ghidurile de utilizare clinică trebuie revizuite.
Etapa 3/2024 (Perioada de raportare: 01.01.2024 – 31.12.2024). Testarea riscului proaritmogen si analiza transport/permeabilitatii BBB pentru AE pe celule hiPSC comerciale/pacienti
Rezumat: În etapa 3/2024 am continuat experimentele de electrofiziologie şi farmacologie cu cenobamat, compus care a prezentat efecte inhibitorii interesante pe multiple canale ionice cardiace umane în etapa precedentă, în special pe hNav1.5 şi hCav1.2. Au fost repetate experimentele pe multiple canale ionice cardiace exprimate stabil sau inductibil în linia celulară HEK293: hNav1.5 (INa), hCav1.2 (α1c+β2+ α 2δ1) (ICaL), hKv7.1+minK (IKs), şi hKv11.1 (hERG) (IKr), s-a realizat titrarea efectelor farmacologice ale cenobamate pe hNav1.5 componenta de curent peak şi componenta tardivă (late), utilizând ATX-II pentru a stabiliza conformaţia canalelor de Na+ corespunzătoare deschiderilor tardive, precum şi titrarea efectelor farmacologice ale cenobamate pe hCav1.2. De asemenea s-au realizat experimente de patch-clamp perforat cu amfotericină pe cardiomiocite ventriculare umane derivate din iPSC (Ncye vCardiomyocytes, Ncardia), cu înregistrarea efectelor cenobamate asupra formei şi parametrilor potenţialelor de acţiune (AP) în current-clamp şi asupra unor componente de curent ionic în voltage-clamp. Folosind noile valori de inhibiţie farmacologică obţinute în aceste noi seturi de experimente au fost reluate calculele pentru predictorul de risc aritmogen Qnet şi calculul efectelor diferitelor concentraţii de cenobamate asupra vitezei de propagare a AP într-un model linear 1D cu 50 cardiomiocite ventriculare (modelate printr-un model O’Hara-Rudy 2011 modificat) în condiţii de conectivitate între cardiomiocite variabilă prin joncţiuni gap. A fost realizat şi un studiu suplimentar de modelare moleculară a interacţiunii cenobamate cu un model structural 3D al Nav1.5 uman în configuraţie deschisă obţinut prin modelare de omologie cu AlphaFold2, inclus într-un bistrat lipidic artificial de DPPC, cu protonare acurată a reziduurilor cu H++, prin docking molecular (Autodock Vina) şi dinamică moleculară (NAMD) urmată de estimarea afinităţii de legare prin MM-GBSA/MM-PBSA. Simulările au fost realizate pentru varianta wild-type a Nav1.5 şi pentru 8 mutante punctiforme ale unor reziduuri din vecinătatea situsului de leagre a cenobamate din cavitatea centrală a canalului Nav1.5. Pentru 3 dintre aceste mutante s-au obţinut afinităţi de legare crescute (Kd scăzute de ~ 3 ori) şi au fost explorate consecinţele aritmogene ale acestor mutaţii. De asemenea am demonstrat că CBM scade permeabilitatea monostratului endotelial şi scade nivelul expresiei P-gp, în celulele endoteliale umane iBMEC. Rezultatele obţinute în cadrul proiectului vor fi testate în viitor într-un studiu pilot pe celule hiPSC derivate de la pacienti.